RG Dr. Franz Klebl

Forschungsprojekte

Regulation von Vitamintransportern in Saccharomyces cerevisiae

Viele Organismen, wie z.B. die meisten Bakterien, Pilze und alle Höheren Pflanzen, sind in der Lage, Biotin de novo zu synthetisieren. Zahlreiche andere Organismen, und hierzu gehören Säuger oder auch Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) haben diese Fähigkeit jedoch verloren und sind von einer Versorgung mit Biotin aus der Nahrung abhängig geworden.  Beim Menschen führt Biotinmangel zu einer Vielzahl klinischer Abnormalitäten, wie neurologischen Befunden, zu reduziertem Wachstum oder zu Hautveränderungen.
In unserer Arbeitsgruppe konnte ein zuvor funktionell nicht charakterisiertes Protein aus Bäckerhefe als putativer Biotinsensor identifiziert und charakterisiert werden. Das VHR1 Protein (= VHT1 regulator 1) steuert die Expression des Vitamin H (Biotin) Transportergens VHT1 in Abhängigkeit von der extrazellulären Biotinkonzentration. (VHT1 Expression wird auf niedrig Biotin induziert); Vht1p ermöglicht dadurch das Wachstum bei Biotinmangel. Vhr1p ist kernlokalisiert und besteht aus zwei Domänen, von denen die eine in Yeast 1-Hybrid Analysen die Funktion eines Transkriptionsaktivators zeigt, während die andere mit der DNA interagiert.

Die Mitwirkung eines Mitglieds des SNF-Transkriptionskomplexes konnte bereits gezeigt und hochspezifische Mutanten analysiert werden.
Wir wollen weitere Interaktionspartner finden und charakterisieren und Signaltransduktionskette des Biotinsensings aufklären. In Bäckerhefe soll ein System zur biotingesteuerten Genexpression etabliert und dieses System auf Pflanzen übertragen werden.

Transporteranalyse im heterologen und homologen System

Die Physiologie und Biochemie des Stofftransports ist ein weiteres Untersuchungsgebiet, insbesondere der Transport über Biomembranen wird in unserer Arbeitsgruppe experimentell untersucht.
Dabei ist die Charakterisierung der Transportproteine hinsichtlich ihrer Substratspezifität, Aufnahmegeschwindigkeit, pH-Abhängigkeit und KM der vordringlichste Schritt zur der Aufklärung ihrer physiologischen Bedeutung.
Meist ist die Charakterisierung in planta aber nicht möglich, deshalb verwenden wir die Bäckerhefe als Werkzeug zur Fremdexpression von Transportern aus Pflanzen (Arabidopsis thaliana, Nicotianum tabacum, Plantago major, Cucurbita pepo) oder dem pflanzenpathogenen Pilz Colletotrichum graminicola.

Abbildung 1: Lokalisation eines Cholintransporters in internen Membranen in Saccharomyces cerevisiae.Das Proten ist mit dem grün-fluoreszierenden Protein (GFP) gekoppelt und kann im Fluoreszenzmikroskop detektiert werden.

Wir verwenden Vektorensysteme mit GFP-Fusionen (um die Lokalisation in Hefe mittels konfokaler Laserscanningmikroskopie zu detektieren) und mit Kompartiment-Targetsequenzen für Vakuole oder Plasmamembran um intern (ER-, Golgi- oder Vesikel-) lokalisierte Membranproteine der Analyse zugänglich zu machen.